El Museo propone un recorrido por las culturas de los pueblos originarios, la época de la conquista y el establecimiento del orden colonial, la Revolución de Mayo, la sociedad porteña en 1810 y el cruce de los Andes, entre otros episodios destacados de la historia argentina.
Así, por ejemplo, se exhibe la histórica bandera que en 1812 acompañó a Manuel Belgrano en las batallas del Alto Perú y que muchos años después fue encontrada detrás de un cuadro en una parroquia de Macha, Bolivia. Había sido escondida por el ejército de Belgrano para preservarla de los enemigos -junto a otra blanca con una franja celeste denominada Bandera de Sucre- y fue encontrada por un párroco mientras limpiaba su capilla. En 1896, el gobierno boliviano cedió la Bandera de Macha al Museo Histórico Nacional argentino, donde se exhibe desde entonces.
Otra de las piezas de enorme valor histórico que expone el Museo es el piano de Mariquita Sánchez de Thompson que ejecutó por primera vez una composición histórica que dio vida al Himno Nacional Argentino. También cuenta con el sable corvo de José de San Martín, considerado un símbolo de la emancipación sudamericana ya que acompañó al Libertador en las luchas por la independencia. Entre las colecciones de pintura, se destacan los óleos del pintor Cándido López, que tienen un gran valor artístico y testimonial porque registran las batallas de la Guerra de la Triple Alianza de la que el artista también participó como soldado.
El acervo se completa con diversos documentos, pinturas y objetos históricos entre los que se destacan una cigarrera que perteneció a Mariano Moreno, un escudo nacional pintado sobre hierro, que estaba en el portal de la Asamblea del Año XIII, entre otros.